С этой целью используют следующие среды:
а) среды Гисса (жидкие и полужидкие с индикаторами). О ферментативной активности бактерий судят по изменению цвета среды и образованию газа;
б) дифференциально-диагностические среды с лактозой (Эндо, Левина. Плоскирева и др.);
в) полиуглеводные среды (типа Олькеницкого, Клиглера и др.).
2. Протеазы - ферменты, разлагающие белки:
а) Для выявления указанных ферментов исследуемую культуру засевают на ряд сред: свернутая сыворотка, столбик желатина (разжижение в положительных случаях), молочный агар в чашке Петри (в положительных случаях вокруг колоний появляются зоны помутнения);
б) расщепление аминокислоты триптофана за счет действия фермента триптафаназы сопровождается образованием индола. Последний выявляется с помощью бумажки, смоченной щавелевой кислотой и укрепленной под пробкой над питательной средой. В положительныхслучаях бумажка краснеет;
в) для выявления ферментов расщепления серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин) ставят пробы на H2S (бумажка, пропитанная ацетатом свинца, чернеет).
г) для выявление аммиака используют лакмусовую бумагу (посинение).
д) для выявления уреазы - фермента, расщепляющего мочевину, в питательную среду нейтральной рН добавляют мочевину и индикатор. В положительных случаях среда изменяет цвет за счет сдвига рН в щелочную сторону в связи с образованием аммиака.
3. Липазы - ферменты разложения липидов и липоидов. Чаще всего определяют лецитиназу посевом на желточный агар. Лецитиназа расщепляет лецитин, при росте колоний вокруг них появляются опалесцирующие зоны, отражающие лецитиназную активность.
4. Гемолизины - ферменты расщепления фосфолипидной мембраны эритроцитов. Они выявляются посевом культуры на кровяной агар (5-10%). Различают бэта-гемолиз или полный гемолиз, когда образуются зоны просветления вокруг колоний, альфа-гемолиз, неполный гемолиз, при наличии зон зеленого цвета вокруг колоний. Отсутствие гемолиза обозначается как гамма-гемолиз.
5. Оксидо-редуктазы:
1. Определение оксидаз. На фильтровальную бумагу, смоченную 1% раствором тетраметилпарафенилендиамина, петлей наносят полосы испытуемой культуры. В положительном случае появляется фиолетовое окрашивание полос (в течение 1 мин).
2. Определение каталазы. Каплю 3% раствора перекиси водорода наносят на предметное стекло и туда вносят петлю испытуемой культуры. В присутствии каталазы образуются пузырьки кислорода.
3. Определение дегидраз. О наличии дегидраз судят по редуцирующей способности микроба, т.е. способности восстанавливать некоторые органические красители (например, 1% водный раствор метиленовой синьки).
Рост и размножение бактерий. Фазы размножения бактерий в закрытых системах.
Ø Рост – координированное воспроизведение всех компонентов бактериальной клетки и увеличение ее биомассы.
Ø Размножение – воспроизводство и увеличение количества клеток, приводящее к образованию бактериальной популяции.
Стадии роста периодической бактериальной культуры:
Фаза (стадия) | Характеристика |
Лаг-фаза | Деления клеток не происходит |
Положительного ускорения | Скорость деления клеток увеличивается |
Логарифмического роста (экспоненциальная) | Скорость деления клеток максимальная |
Отрицательного ускорения | Скорость деления клеток снижается |
Стационарная фаза максимума | Количество живых клеток постоянно |
Ускоренной гибели | Количество живых клеток начинает снижаться (убывает с увеличивающейся скоростью) |
Логарифмической гибели | Количество живых клеток убывает с максимальной скоростью |
Уменьшения скорости гибели | Количество живых клеток убывает с уменьшающейся скоростью |
Стационарная фаза минимума | Количество живых клеток минимально |
Классификация микроорганизмов по типу дыхания. Культивирование анаэробных бактерий. Этапы выделения культур анаэробных бактерий.
В зависимости от того, какую роль кислород играет в процессах получения энергии, все микроорганизмы подразделяются на 6 групп:
1) облигатные аэробы - им необходимо большое количество кислорода;
2) микроарофилы - кислород необходим в небольших количествах, меньше, чем в атмосферном воздухе;
3) капнофилы - при культивировании необходимы O2 и CO2;
4) облигатные анаэробы - не могут расти в присутствии кислорода;
5) аэротолерантные анаэробы - могут расти в присутствии небольшого количества кислорода;
6) факультативные анаэробы - используют как аэробное, так и анаэробное дыхание, или ферментирование. Это зависит от доступности кислорода.
Культивирование и выделение чистых культур анаэробных бактерий.
Культивирование анаэробов производят в бескислородных условиях или создают сниженное парциальное содержание кислорода в среде или в воздухе. Отношение бактерий к кислороду можно определить, произведя посев культуры уколом в столбик агаризованной питательной среды. Аэробы вырастут на поверхности столбика, анаэробы - в глубоких слоях ПС. Факультативные анаэробы будут расти как на поверхности среды, так и в ее глубине.
Необходимые условия для культивирования анаэробных микроорганизмов создаются физическими, химическими и биологическими методами.
Физические методы.
Регенерация (кипячение) жидких питательных сред.
После посева их заливают сверху слоем парафинового или вазелинового масла для разобщения от атмосферного воздуха.
Посев в «высокий столбик».
Кислород воздуха диффундирует обычно на расстоянии 1,5-2,0 см от поверхности среды, а в глубине создаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов.
Выращивание культур в анаэростатах.
Анаэростаты представляют собой металлические цилиндрические сосуды с герметически закрывающейся крышкой, в которой имеется ниппель для соединения его с насосом с помощью вакуумной резиновой трубки. Из анаэростата вакуумным насосом откачивается воздух. Степень разреженности воздуха контролирует манометр.
Аппарат Киппа. Более старый способ замены воздуха индифферентным газом, например водородом.
Химические методы.
1. Добавление в среду редуцирующих и легко окисляемых веществ.
Добавляют кусочки паренхиматозных органов ( печень, селезенка и др. ), глюкозу, аскорбиновую кислоту, цистеин. Применяют и неорганические восстановители: сульфиды, сероводород, цитраты.
2.Химическое поглощение кислорода воздуха происходит при добавлении, например щелочного раствора пирогаллолав особых приборах, примером которого может служить свеча Омелянского - стеклянный прибор в форме свечи. Внутрь помещают одну пробирку с жидкой средой с посевом анаэробов (среда Китта-Тароции). На дно прибора наливают щелочной раствор пирогаллола. Сверху прибор закрывают стеклянным колпачком и парафинируют;
3. Для образования водорода и углекислого газа, необходимых для роста облигатных анаэробов используются специальные пакеты, при добавлении воды в которые происходит активация с выделением соединений, которые связывают кислород воздуха (газогенераторные пакеты).
Биологические методы.
1.Совместное выращивание анаэробов и аэробов - Метод Фортнера. В основе метода лежит комбинированный посев культур анаэробов и аэробов. Посев производят в чашку Петри с толстым слоем сахарного кровяного агара (агар Цейсслера), который разделяют посредине чашки прокаленным стерильным скальпелем, вырезая небольшую полоску агара по диаметру. На одну половину среды засевают культуру аэробных бактерий, на другую - анаэробных. Чашку парафинируют и помещают в термостат. При росте аэробы поглощают кислород и создают тем самым условия для роста анаэробных бактерий.
2. Использование в питательных средах биологических редуцирующих веществ (кусочков печени, почек, крови, и др.).
Среда Китта-Тароции. Состав: МПБ, кусочки печени, глюкоза. Готовую среду сверху заливают слоем вазелинового масла и стерилизуют. Посев материала производят пастеровской пипеткой под слой масла.
Среда Цейсслера. Состав: МПА, 1% глюкоза, 20% дефибринированной крови. Используется для получения изолированных колоний анаэробных микроорганизмов, а также для изучения гемолитической активности бактерий.