Лекции.ИНФО


ПОПУЛЯЦИОННО-СТАТИСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ



Методы, используемые для установления частот генов и генотипов в популяции, демонстрирующие характер их изменения под влиянием окружающей среды и раз раз­личных факторов популяционной динамики, носят название популяционно-стати­стических.

С помощью этих методов можно:

• определить частоты генов, степень гетерозиготности и полиморфизма,

• установить, как меняются частоты генов под действием отбора,

• выявить влияние факторов популяционной динамики на частоты тех или иных

генотипов и фенотипов,

• проанализировать влияние факторов внешней среды на экспрессию генов,

• определить степень межпопуляционного генетического разнообразия и вычис­лить генетическое расстояние между популяциями.

Так же методы популяционно-статистического анализа могут быть использованы для определения и подтверждения типов наследования заболевания, являясь осно­вой применения математической статистики в клинико-генетическом анализе.

Популяционно-генетические исследования включают следующие этапы:

1) подбор популяции с учетом демографических характеристик,

2) сбор материала,

3) выбор метода статистического анализа.

Генетическое изучение популяций человека предполагает знание их демографи­ческих характеристик (размер популяций, рождаемость, смертность, возрастная структура, национальный состав), а также географических и климатических условий жизни, религиозных убеждений и т.д. Это связано с некоторыми особенностями по­пуляций человека, которые могут быть панмиксными (случайные браки) и инбред- ными (высокая частота кровнородственных браков). В популяциях человека форми­рование субпопуляций связано с такими формами изоляции, которые свойственны только человеку, например расовая, социальная (социальное положение, экономи­ческие, этнические, языковые, административные), конфессиональная и идеологи­ческая. Все это необходимо учитывать при интерпретации полученных при погтуля- ционно-генетических исследованиях результатов. Во избежание получения недосто­верных результатов, выбираемая для изучения популяция также не должна быть очень большой или очень малой. Чем больше по размеру популяция (но не до беско­нечности), тем выше уровень ее разнообразия и тем сложнее ее генетическая струк­тура, а также ближе соответствие между реально наблюдаемыми и ожидаемыми ген­ными частотами. Так для генетических исследований оптимальным считается размер популяции с численностью от 0,5—5,0 млн. человек.

В настоящее время для сбора материала при проведении популяционно-генети­ческого исследования используется обзорный метод и его различные модификации, т.е. можно исследовать всю наследственную патологию, или отдельную группу заболе­ваний, или только одно заболевание, но изучая все население выбранного региона.

Наследственные заболевания распределены по различным регионам земного ша­ра, среди разных рас и народностей неравномерно, а знания о распределении частот заболеваний и количестве гетерозигот в регионе способствуют правильной органи­зации профилактических мероприятий. Если известна частота заболевания в попу­ляции, и при допущении, что эта популяция находится в генетическом равновесии по данному признаку, для расчета частот генотипов и фенотипов наиболее широко применяется формула Харди-Вайнберга. Для диаллельной системы — она имеет вид р2 + 2pq + q2 = (p + q)2= 1, для трехаллельной - (а + Ь + с)2 = 1). (Подробнее о зако­не Харди-Вайнберга и условиях его выполнения см. гл. 17). Например, частота ФКУ в популяции составляет 1:10000, т.е. q2 = 0,0001, значит q = 0,01. По закону Хар­ди-Вайнберга р + q = 1, отсюда р= 1 — q = 1-0,01 = 0,99, а 2pq = 2 х 0,99 х 0,01 = 0,0198. Таким образом, частота гетерозигот по гену ФКУ в изучаемой популяции со­ставляет приблизительно 2%.

На практике при расчете частоты гетерозигот иногда принимают приближенное зна­чение р (р = 1) и, соответственно, 2pq = 2q. Рассмотрим следующий пример. Частота му- ковисццдоза 1:2500, значит q2 = 0,0004, q = 0,02. По определению р + q = 1, отсюда р = 1 - <7 = 1 - 0,02 = 0,98, a 2pq=2q = 2 * 0,02 = 0,04. Таким образом, частота гетерозигот по ге­ну муковисцидоза в изучаемой популяции составляет приблизительно 4%.

Для установления и подтверждения типа наследования заболеваний необходимо проверить соответствие сегрегации (расщепления) по исследуемому признаку в отя­гощенных семьях данной популяции менделевским закономерностям. При правиль­ном сборе материала соотношение больных и здоровых сибсов одного и того же по­коления и сегрегационная частота (частота с которой ген сегрегирует в исследуемых семьях) будут соответствовать определенному типу наследования. Методом х-квад­рат подтверждается соответствие количества больных и здоровых сибсов для ауто- сомно-доминантной патологии в семьях с полной регистрацией (через больных ро­дителей):

где О - ожидаемое, Н — наблюдаемое количество больных или здоровых сибсов в выявленных семьях.

Для расчета сегрегационной частоты (р) можно использовать ряд методов: метод сибсов Вайнберга, пробандовый метод.

Методы сибсов Вайнберга и пробандовый используются в случае регистрации се-мей через больных детей: при рецессивной патологии (родители здоровы) и при ау- тосомно-доминантных заболеваниях в случае неполной регистрации.

Метод сибсов Вайнберга может применяться только при исследовании всей попу-ляции или случайной выборки, в которой каждый больной имеет одинаковую веро-ятность попасть в нее и все больные имеют равные шансы стать пробандом, иными словами все пораженные должны являться пробандами. Сущность этого метода со-стоит в подсчете отношения суммарного количества больных сибсов к общему коли-честву их здоровых братьев и сестер, соответственно: ), где г — число больных в семье, s — число детей в семье.

При использовании этого метода существует вероятность получения искаженных результатов, что обусловлено следующими причинами: малое количество детей в семьях, попавших в выборку; неполная пенетрантность или скрытое носительство мутантного гена; наличие стертых форм и разных стадий болезни; пропуск семей в случае рождения здорового ребенка от гетерозиготных родителей.

Пробандовый метод применяется в практике популяционно-генетических иссле-дований гораздо чаще. Он используется при изучении клинического материала слу-чайно попавшего под наблюдение, т.е. если не все пораженные сибсы были зареги-стрированы в качестве пробандов.

Так как на практике в поле зрения исследователя попадают семьи, в которых хотя бы один ребенок болен, для восстановления истинного соотношения при учете сибсов Вайнберг предложил исключать пробанда. В результате формула расчета сег-регационной частоты имеет вид:

где а — число пробандов, г — число больных, s - число детей в данной семье.

К тому же, при помощи пробандового метода можно оценить полноту выявления семей сданной патологией или вероятность регистрации:

При современных популяционных исследованиях используются более сложные, модифицированные и компьютеризованные методы расчетов (методы взвешенных шансов и линейной интерполяции), но основанные на тех же принципах.

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД

Анализ кариотипа человека проводят в культуре делящихся соматических и половых клеток. Наиболее часто при цитогенетических исследованиях в медицинской генетике используют культуру клеток периферической крови, прежде всего лимфоцитов, костного мозга и фибробластов. Наиболее доступны для исследований лимфоциты периферической крови, которые, в большинстве случаев и служат объектом цитогенетического анализа у человека в постнатальном периоде. Для анализа кариотипа плода могут быть использованы различные клеточные культуры; их выбор диктуется сроком беременности, в котором проводится исследование. Так, на раннем сроке (до 12 недель внутриутробного развития) анализ хромосом целесообразно проводить в клетках ворсин хориона, в то время как в более позднем сроке цитогенетическому исследованию подвергают клетки плода, выделенные из амниотической жидкости, пуповинной крови и плаценты (гл. 25).

Для исследования кариотипа человека достаточно получить образец периферической крови в количестве 1—2 мл. Цитогенетический анализ включает три основных этапа: 1) культивирование клеток; 2) окраску препарата; 3) микроскопический анализ препарата. Культивирование клеток проводится следующим образом. После забора образец крови помещают в питательную солевую среду с добавлением цельной сыворотки крупного рогатого скота и белка бобовых растений — фитогемагглютинина, стимулирующего процесс деления клеток. Успех цитогенетического исследования в значительной мере определяется тем, сколько клеток в культуре будут находиться в стадии мегафазы. Для увеличения количества метафазных клеток за полтора часа до окончания культивирования в культуру вводят колхицин, который разрушает клеточное веретено, приостанавливает деление клеток на стадии мегафазы и увеличивает конденсацию хромосом. Обычно, продолжительность культивирования составляет 72 ч. После его окончания клетки с питательной средой центрифугируют и помещают в гипотонический раствор хлорида калия или цитрата натрия. Гипотоническая обработка приводит к разрыву ядерной оболочки и межхромосомных связей и сво-бодному перемещению хромосом в цитоплазме. После этого производится фиксация клеток смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1, после чего кле-точную суспензию раскапывают на охлажденные влажные предметные стекла и вы-сушивают на воздухе.

На следующем этапе цитогенетического исследования производится окраска препаратов. В зависимости от целей исследования, то есть от того, какой именно тип перестроек необходимо выявить, можно использовать различные виды окрашивания.

Наиболее простой метод окрашивания хромосом, называемый в настоящее время сплошным или рутинным, применяют для определения количества хромосом в препарате и выявления геномных мутаций и анеуплоидий. При этой окраске ис-пользуют краситель Гимзы, который равномерно прокрашивает хромосомы по всей длине, что дает возможность идентифицировать хромосомы и оценить их количество в препарате. Этот метод окраски успешно применялся до 70-х годов прошлого века и позволил выявить этиологию большинства хромосомных синдромов, характе-ризующихся изменением количества хромосом. В настоящее время сплошное окра шивание применяют, в основном, для выявления количественных аномалий кариотипа, а также специфического сайта ломкости при синдроме фрагильной X- хромосомы. Препарат метафазных хромосом человека, окрашенных по всей длине, представлен на рис. 19.6, а.

Однако использование рутинного метода окраски не позволяет выявлять структурные перестройки хромосом. В этих случаях применяют специальные методы, так называемой, дифференциальной окраски, в результате которой хро-мосомы приобретают поперечную исчерченность. Расположение и толщина темных и светлых полос строго индивидуальны для каждой хромосомы, что позволяет проводить их точную идентификацию и выявлять структурные перестройки. Для объяснения возникновения различно окрашенных полос на хромосомах выдвигается несколько гипотез: различия в количественном содержании А—Т- и G—С-пар оснований, особенности строения нуклеосом, а также асинхронность репликации различных участков ДНК.

Наибольшее распространение получил простой и эффективный G-метод диффе-ренциального окрашивания. В этом случае для окрашивания хромосом также используют краситель Гимзы, однако, хромосомы предварительно обрабатывают раствором трипсина. Процедура окрашивания занимает от 5 до 10 минут и приводит к появлению специфичного для каждой хромосомы рисунка поперечной исчерченности. Показано. что количество полос в метафазных и прометафазных пластинках существенно различается: в метафазных пластинках их число достигает 400, а в прометафазных — от 800 до 1000. Препарат метафазных хромосом человека, окрашенных по G- методу, представлен на рис. 19.6, б.

Другие методы окраски используются реже вследствие их сложности или узкой специфичности. R-метод обусловливает сегментацию хромосом, противоположную той, которая имеет место при окраске G-методом.

С-метод дифференциальной окраски позволяет анализировать лишь некоторые районы хромосом — участки так называемого конститутивного гетерохроматина, локализованного в околоцентромерных областях длинных плеч хромосом 1, 9 и 16, в длинном плече Y-хромосомы, а также в коротких плечах акроцентрических хромо-сом.

Для дифференциальной окраски хромосом могут использоваться флуорохромы: акрихин, акрихин-иприт, квинакрин и другие (Q-метод окраски). По результатам дифференциальной флуоресцентной окраски идентифицируют каждую пару гомо-логов, а по свечению Y-хроматина определяют наличие Y-хромосомы в интерфазном

ядре.

Третий этап исследования кариотипа человека заключается в световом микро- скопировании фиксированных и окрашенных препаратов метафазных хромосом. Для адекватного выявления хромосомных аномалий необходимо проанализировать не менее 30 метафазных пластинок. В том случае, если предполагается мозаицизм по хромосомным аномалиям, количество анализируемых хромосом должно быть увеличено. Число клеток (п) необходимых для анализа с целью определения задан-ного уровня мозаицизма можно определить по формуле биноминального распределения: Р = (1 — р)п, где р — заданный уровень мозаицизма, Р — вероятность обнаружения мозаицизма. Учитывая, что в различных клетках организма количест-во нормальных и аномальных клонов может различаться, для выявления мозаицизма может потребоваться анализ нескольких тканей, например, клеток крови, фиб- робластов, половых желез.

МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД

В ряде случаев использование традиционного цитогенетического метода не позволя-ет идентифицировать все имеющиеся хромосомные перестройки, особенно если в них вовлечены более двух хромосом или они захватывают очень малый по размеру участок. Для этих целей в последние годы разработаны новые высокоинформатив-ные молекулярно-цитогенетические методы, главный из которых флуоресцентная гибридизация in situ, или так называемый FISH-метод (от англ. fluorescent in situ hybridization). С помощью этого метода можно проводить гибридизацию метафазных или интерфазных хромосом с различными ДНК-зондами, меченными флуоресцирующими веществами (гл. 18). Зонды представляют собой клонированные последовательности или выделенные участки ДНК. Наиболее часто используют высокоповторяющиеся последовательности ДНК центромерных или перицетромерных районов, однако, в ряде случаев возникает необходимость в применении уникальных ДНК- последовательностей, таких как космидные клоны или анонимные последовательности. С их помощью удается не только идентифицировать различные типы структурных хромосомных перестроек, но и провести более тонкий генетический анализ (например, идентифицировать точки разрыва при транслокациях, инверсиях, делениях, а также структуру маркерных хромосом).

В некоторых случаях, особенно при возникновении сложных транслокаций с во-влечением нескольких хромосом, возникает необходимость использовать в процессе гибридизации большое число флуоресцирующих ДНК-зондов, которые иногда прокрашивают хромосому практически целиком. Такую модификацию FISH-метода называют супрессорной гибридизацией. Для успешного осуществления этих методов созданы специальные библиотеки хромосомоспецифичных участков ДНК. В пос-ледние годы при проведении FISH-анализа все чаще используют ДНК-зонды, ме-ченные различными цветами. Применение разноцветных зондов позволяет более быстро и эффективно провести анализ количественных и структурных перестроек хромосом, особенно, в случае пренатальной экспресс-диагностики. 

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ НОРМАЛЬНОГО КАРИОТИПА ЧЕЛОВЕКА

Для описания нормального кариотипа человека, а также для обозначения структур-ных и количественных перестроек хромосом используется определенная универ-сальная схема и специальные символы. Описание кариотипа начинают с указания общего количества хромосом в клетке, после чего ставится запятая и обозначается набор половых хромосом, указывающий на пол обследованного. Например, запись 46,XX характеризует нормальный кариотип женщины, а 46,XY — нормальный кари-отип мужчины. Если хромосомных перестроек у обследованного не выявлено, то за-пись на этом заканчивается. В ряде случаев, при обследовании обнаруживают, так называемый, нормальный полиморфизм хромосом - индивидуальные особенности их строения. Полиморфизм наиболее характерен для акроцентрических хромосом и, как правило, отражает вариабельность размеров гетерохроматиновых сегментов, наличие спутников и спутничных нитей в области коротких плеч и их величину (рис. 19.7). Иногда в качестве вариантов нормального кариотипа рассматривают наличие ломких сайтов хромосом, часто выявляемых при культивировании в определенной среде. В большинстве случаев наличие полиморфизма строения хромосом не приво-дит к возникновению патологических симптомов у их обладателя. Отсутствие пато-логических последствий при увеличении размеров гетерохроматиновых блоков хро-мосом можно объяснить особенностью строения гетерохроматина. Показано, что в его структуру входит ДНК с многократно повторяющимися последовательностями, количественные изменения которой не приводят к существенному генному дисба-лансу. Кроме того, считается, что некодирующая саттелитная ДНК гетерохромати-новых районов некоторых хромосом может способствовать повышению уровня функционирования генома.

Необходимо отметить, что иногда наличие нормального полиморфизма хромосом, все-таки увеличивает риск рождения ребенка с хромосомными аномалиями.

Существуют данные, свидетельствующие о том, что среди супружеских пар, у кото­рых наблюдалось рождение детей с пороками развития, а также страдающих беспло­дием и привычным невынашиванием беременности, статистически значимо чаще выявляется носительство хромосом с крупными гетерохроматиновыми блоками. Преобладание лиц с увеличенными в размере гетерохроматиновыми сегментами в акроцентрических хромосомах, а также хромосомах 1,9 и 16, отмечено в группе де­тей с множественными врожденными пороками развития невыясненной этиологии и олигофренией.

Обозначения основных вариантов полиморфизма нормального кариотипа чело­века представлены в табл. 19.2.

Достаточно часто в популяции здоровых людей при цитогенетическом анализе выявляется заметное увеличение коротких плеч некоторых хромосом (например, хромосомы 15). Изучение нормального полиморфизма хромосом может иметь зна­чение для определения родительского происхождения хромосомной перестройки. Если установлено, от кого из родителей унаследован полиморфизм хромосом, то это указывается при записи кариотипа. Например, запись 46,XX, 15ps+pat означает, что женщиной от отца унаследованы увеличенные спутники на хромосоме 15, а запись 46,XY,16 qh+ mat указывает на материнское наследование увеличенного в размере гетерохроматина хромосомы 16.









Читайте также:

Последнее изменение этой страницы: 2016-04-11; Просмотров: 69;


lektsia.info 2017 год. Все права принадлежат их авторам! Главная