Для выявления некоторых бактерий и отдельных структур клеток применяют специальные методы окраски.
Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена:
1. На фиксированный мазок наносят карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3-5 минут.
2. Снимают бумагу, промывают мазок водой.
3. На мазок наносят 5% раствор серной кислоты или 3% раствор солянокислого спирта на 1-2 минуты для обесцвечивания.
4. Промывают водой.
5. Докрашивают мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 минут.
6. Промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Выявление капсулы по методу Гинса:
1. На предметное стекло наносят каплю туши, а рядом – каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно перемешивают и с помощью шлифованного стекла готовят мазок.
2. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют на пламени горелки.
3. Мазок окрашивают фуксином в разведении 1:3 или сафранином. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными и выделяются на темном фоне препарата.
Окраска жгутиков по Леффлеру:
1. Взвесь бактерий переносят в каплю воды, не перемешивают и высушивают.
2. Обрабатывают препарат 15-20 минут протравой (1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина + смесь из 10 мл 25% водного раствора танина с 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа).
3. Тщательно промывают водой и высушивают на воздухе.
4. Докрашивают фуксином Циля в течение 3-4 минут при легком подогревании.
5. Промывают водой, высушивают, микроскопируют.
Окраска спор по методу Ожешки:
1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 минут.
2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки.
3. Окрашивают препарат по Цилю-Нильсену. Споры бактерий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.
Изучение микробов в живом состоянии
Клетки микроорганизмов в живом состоянии изучают методом раздавленной капли и методом висячей капли.
Метод раздавленной капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за края покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом х40. Метод раздавленной капли удобен для исследования подвижности бактериальных клеток, а также для изучения крупных микроорганизмов - плесневых грибов, дрожжей.
Метод висячей капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят каплю бактериальной суспензии. Затем предметное стекло с лункой, края которого предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Препарат переворачивают покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии используют вначале малый сухой объектив х8, под увеличением которого находят края капли, а затем устанавливают объектив х40 и исследуют препарат.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Основные структурные элементы бактериальной клетки, их функции.
2. Особенности строения клеточной стенки. Строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.
3. Спорообразование у бактерий.
4. Включения в цитоплазму бактериальной клетки.
5. Простые методы окраски микробов.
6. Сложные методы окраски микробов (методы Грама, Циля-Нильсена, Бурри-Гинса, Ожешко). Методы обнаружения капсул, жгутиков, спор бактерий.
7. Сущность окраски микробов по Граму.
8. Техника приготовления мазков на предметных стеклах. Техника приготовления двух и более мазков на одном стекле.
9. Техника окраски микробов по Граму. Распределение микроорганизмов в зависимости от окраски по Граму.
10. Методы изучения микробов в живом состоянии.
Литература для подготовки к занятию:
Основная литература:
1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004.
Дополнительная литература:
1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.
2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.
Ультраструктура бактериальной клетки
1. Нуклеоид – генетический аппарат бактерий. Содержит ДНК, РНК, белки (отсутствуют мембрана, гистоны, не делится митозом).
2. Цитоплазма - коллоидный раствор белков, углеводов, липидов, минеральных веществ (цитозоль), в котором находятся структурные элементы (рибосомы, нуклеоид, включения, плазмиды):
- рибосомы – место синтеза белка;
- плазмиды – автономная молекула ДНК с дополнительной генетической информацией (способность к конъюгации, резистентность к лекарственным препаратам, синтез токсинов и др.);
- включения (волютин, гликоген, крахмал, сера) – запас питательных веществ.
3. Цитоплазматическая мембрана – трехслойная мембрана (два слоя фосфолипидов и слой белка); функция - транспорт питательных веществ.
4. Мезосомы – производные (впячивания) цитоплазматической мембраны (ламинарные, везикулярные, трубчатые); функция – участие в делении клетки и в секреции веществ.
5. Клеточная стенка – структура, придающая бактериям постоянную определенную форму. Основа – пептидогликан (параллельно расположенные поперечные молекулы гликана, соединенные тетрапептидом). У грамположительных бактерий пептидогликан многослойный, прошит тейхоевой и липотейхоевой кислотами. У грамотрицательных бактерий пептидогликан однослойный, связан с помощью липопротеина с наружной мембраной, состоящей из липополисахаридов, фосфолипидов и белков.
6. Жгутики – тонкие нити, берущие начало от цитоплазматической мембраны, аппарат передвижения: монотрихи, амфитрихи, лофотрихи, перитрихи (аэротаксис, фототаксис). Состав – белок флагеллин (Н-антиген). Обнаруживаются при окраске по Леффлеру.
7. Пили (ворсинки, фимбрии) – нитевидные образования, берущие начало от поверхности клетки:
- пили первого типа – общие пили (100-200), адгезивные;
- пили второго типа – конъюгативные (половые) пили (1-4).
Состав – белок пилин.
8. Капсула (макрокапсула, слизистый чехол, микрокапсула). Химическое строение – полисахарид. Образуется главным образом в макроорганизме. Защищает бактерии от факторов макроорганизма. Определяет типоспецифичность бактерий. Обнаруживается при окраске по Бурри-Гинсу.
9. Спора – форма сохранения вида в неблагоприятных условиях. Не является способом размножения. Место расположения в клетке – центральное, субтерминальное, терминальное. Обнаруживаются при окраске по методу Ожешки (Цилю-Нильсену).
ЗАНЯТИЕ 3
ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Действие физических и химических факторов на микроорганизмы. Стерилизация. Методы стерилизации. Дезинфекция. Основные группы дезинфицирующих и антисептических веществ, механизм их антибактериального действия. Физиология бактерий. Питание микроорганизмов. Питательные среды, их классификация. Техника посева в жидкие и на плотные питательные среды. Бактериологический метод (первый этап).
УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Изучить действие физических и химических факторов на микроорганизмы. Ознакомиться с методами стерилизации и дезинфекции. Познакомиться с основными группами дезинфицирующих и антисептических веществ, механизмами их антибактериального действия. Познакомиться с понятием “физиология бактерий”, типами питания микроорганизмов, классификацией питательных сред. Освоить технику посева бактерий в жидкие и на плотные питательные среды.
ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:
1. Изучить действие физических и химических факторов на микроорганизмы.
2. Ознакомиться с методами стерилизации и дезинфекции.
3. Изучить основные группы дезинфицирующих и антисептических веществ, механизмы их антибактериального действия.
4. Познакомиться с типами питания микроорганизмов и с классификацией питательных сред.
5. Освоить технику посева бактерий в жидкие и на плотные питательные среды.