Выполнил: Новак А.Л., 301 гр., л/ф, Владивосток, 1998. Актуальность
проблемы
Особо опасные инфекции (ООИ) — это инфекции, которые могут
возникать среди населения в виде отдельных заболеваний, эпидемий и
даже пандемий, чаще сопровождая ЧС (стихийные бедствия, войны,
массовый голод и т.п.), характеризующиеся природной очаговостью,
быстрым распространением и тяжелым течением. Единого во всем мире
мнения о том, какие инфекции следует причислять к ООИ пока нет,
отечественные эпидемиологи придерживаются такого перечня:
Чума
Туляремия
Миелоидоз
Геморрагические лихорадки
Желтая лихорадка
Холера
Генерализованная форма сибирской язвы
Наиболее вероятное появление ООИ возможно во время ЧС. Резкое
ухудшение санитарно-гигиенических условий обостряет эпидемическую
ситуацию по инфекциям, которые раннее имели эндемических характер,
а завезение инфекции извне прибывающими лицами приводит к тому, что
потенциальные источники инфекции оказываются неизолированными и в
течение длительного времени имеют многочисленные контакты с
окружающими их лицами. В связи с этим до установления
окончательного диагноза заболевания соблюдается строгий
противоэпидемический режим.
При первых признаках или подозрении на ООИ осуществляется:
Выявление контактных лиц и их обсервация;
Дача антибиотиков широкого спектра действия (доксицилин,
тетрациклин и др.), т.е. экстренная профилактика;
Проведение дезинфекционных мероприятий;
Отбор материала от больных и доставка его в лабораторию для
микробиологического исследования;
Организация частичной (полной) санобработки конкретных лиц.
В данной работе разбирается этап диагностики ООИ на примере чумы,
холеры и туляремии. Если диагноз установлен с достаточной
достоверностью, можно определить характер противоэпидемических
мероприятий, установить возможный источник инфекции и механизмы его
передачи. Именно по этому необходимо и оправдано применение
экспресс-методов диагностики ООИ. Общие принципы
экспресс-диагностики состояний инфекции и иммунитета
Современная иммунология исключительно многолика, а сферы применения
иммунологических знаний и методов беспредельно разнообразны. Они
используются практически во всех разделах биологии, ветеринарии и
медицины — от фундаментальных молекулярно-биологических
исследовании до медико-генетического консультирования и множества
других сугубо практических процедур, осуществляемых растениеводами,
животноводами и медиками. И, тем не менее, особенно важным в
социальном отношении и методически наиболее передовым продолжает
быть тот старейший и неуклонно развивающейся раздел иммунологии,
успехами которого обеспечивается развитие теории и осуществление
практики противоэпидемической работы-диагностики, профилактики и
лечения инфекционных заболеваний. А методы иммунологической
экспресс-диагностики имеют ключевое значение для эффективного
решения названных проблем и осуществления всех соответствующих
противоэпидемических мероприятий. Следующие ниже материалы и
посвящены именно этому разделу прикладной иммунологии, его
состоянию и перспективам развития.
Важнейшей предпосылкой эффективности любых противоэпидемических
мероприятий является своевременное прогнозирование и обнаружение
моментов активизации тех экологических и социально-экологических
взаимодействий, которые составляют существо эпидемических
процессов. Исключительное разнообразие, свойственное последним и
требующее дифференциации противоэпидемических мероприятий,
обусловлено не только самобытностью каждой из существующего
множества инфекционных болезней. Очень большое значение имеет в
этом отношении фундаментальное явление гетерогенности популяций,
входящих в состав соответствующих экологических и
социально-экологических систем микроб-жертва. Вариабильность этих
весьма сложных биосоциальных факторов и условий в очень большой
мере влияет на специфику того или иного этапа существования каждого
эпидемического процесса. И своевременное распознавание этих
особенностей, осуществляемое, как правило, с использованием
иммунологических методов, обеспечивает ту дифференциацию
противоэпидемических мероприятий.
Экспресс-индикация — это своеобразная разведка большой армии
лабораторной диагностики. Она находится на переднем крае научного
поиска новых, простых, экономичных, быстрых методов индикации
микробов, часть из которых в дальнейшем идет на вооружение
лабораторной практики и благодаря этому последняя все время
совершенствуется.
Основные объективные требования к экспрессным методам диагностики
инфекционных заболеваний сводятся к следующему:
1. получение результатов анализа в максимально короткие сроки
(часы, идеально-минуты);
2. возможность проведения и завершения анализа без выделения
искомого микроорганизма в чистой культуре, при использовании только
нативного материала, в крайнем случае-с привлечением элективных
биосред для быстрого накопления возбудителей;
3. бесспорно высокая специфичность и высокая чувствительность, как
предпосылки надлежащей достоверности анализа;
4. высокая производительность, простота, доступность и
воспроизводимость анализов.
Эти требования в равной мере приложимы и к методам экспрессной
диагностики состояний иммунитета. Предпочтительность использования
того или иного из существующих методов экспресс-диагностики зависит
от многих конкретных условий. Однако наиболее желательным является
параллельное использование 2-3 методов. Такой подход значительно
увеличивает надежность получаемого результата.
На ближайшие годы наиболее перспективными следующие направления
развития экспресс-индикации микроорганизмов.
Энзимоиндикационное направление, связанное с экспресс-индикацией
биохимических свойств и определением ферментативного спектра
микробов. По-прежнему сохранят свою значимость исследования по
разработке политропных (полисубстратных) питательных сред. В нашей
стране были разработаны оригинальные политропные среды и их
комбинации, которые с успехом применяются в лабораторной практике.
При создании сложных поликомпонентных питательных систем необходимо
исходить из различных биохимических и энергетических потребностей
микроорганизмов. Для лучшего проявления жизнедеятельности и
биохимической активности патогенных и других микробов в средах
необходимо создавать оптимальные условия для их роста и размножения
и одновременно вводить ферментируемые субстраты (углеводы,
многоатомные спирты, аминокислоты и др.) с наиболее чувствительными
индикаторами, которые быстро бы регистрировали их ферментацию. В
результате применения оптимальных полисубстратных сред производится
выделение и накопление чистой культуры микробов с одновременным
определением их биохимических признаков. Перспективным следует
рассматривать развитие энзимоиндикационных методов, в которых
субстрат с индикатором отделен от питательной среды и фиксирован на
специальном носителе. В нашей стране разработаны углеводно-бумажные
диски с защитной пленкой (бумажные реагенты для определения
дезаминаз у микробов) и их аналоги БИС (бумажно-индикаторные
системы), углеводно-бумажные поплавки, углеводно-полимерные пленки.
Все эти препараты являются весьма перспективными, они позволяют в
течение кратчайшего срока (3-5 ч), используя общепринятые
питательные среды и лабораторную посуду, определять ферментативную
активность различных видов микроорганизмов. Автономный препарат —
карандаш-фермент, не имеющий аналогов ни у нас, ни за рубежом,
позволяет без применения питательных сред непосредственно на
предметном стекле определять биохимические свойства микробов.
Полисубстратная тест-система и энзимоиндикаторная лента
используются для одновременной идентификации 20 биохимических
признаков у микробов. Это новые виды простых «долгоживущих»
препаратов, предназначенных для быстрого и экономичного определения
биохимических свойств микробов. Электрофизический метод определения
ферментативной активности микробов включает посев микробной
культуры на жидкие питательные среды, содержащие пептонную воду,
различные углеводы, многоатомные спирты, аминокислоты с последующим
ферментативным расщеплением исследуемых веществ и образованием
различных ионизированных продуктов распад по природе, форме и
величине виды мелкодисперсных носителей (сорбентов) антигенов и
антител, способствующих повышению чувствительности комплексных
иммунологических методов. Реакции пассивной гемагглютинации и их
модификации связаны с использованием эритроцитарных диагностических
препаратов. Эритроцитарную диагностику с успехом применяются для
ускоренного обнаружения и идентификации как патогенных, так и
условно-патогенных микроорганизмов (например, возбудителей
туляремии, бруцеллеза, сальмонеллеза и др.) в различных
патологических материалах, получаемых от больных, и в объектах
внешней среды. Реакции с эритроцитарными диагностикумами являются
весьма чувствительными, и в этом отношении часто превосходят другие
серологические реакции. Они введены в официальные инструкции по
экспресс-индикации бактериальных агентов в элементах внешней среды
и в материалах, полученных от пораженных людей и животных.
Одновременно продолжаются поиски новых носителей антигенов и
антител, которые были бы безантигенными, стабильными, не
разрушающимися при длительном хранении, а применяемые реакции —
простыми по технике постановки (например, стекольные тесты) и
исследования с их помощью — экономичными. Совершенствуются реакции
с применением цветных целлюлозных частиц в качестве носителей
антигенов и антител.
Положительными свойствами такого рода препаратов являются:
отсутствие собственной антигенности;
стабильность при длительном хранении;
демонстративность и простота техники постановки реакции, обычно на
предметном стекле;
высокая скорость прохождения реакции;
экономичность.
Кроме того, полезным и оправданным считаем поиск новых носителей
антигенов и антител. В этом отношении перспективными являются
ионообменные смолы, латексы, целлюлоза и ее производные и ряд
других веществ, которые могут способствовать повышению
чувствительности серологических реакций.
Иммунохимическое направление, связанное с использованием
разнообразных комплексных соединений специфических антител или
антигенов с химическими веществами. Присоединенные химические
вещества придают им новые феноменологические способности и
свойства, тем самым, расширяя возможности экспресс-индикации
микробных агентов в частности и лабораторного анализа вообще.
Большую популярность и практическую значимость приобрели методы
быстрого иммунофлуоресцентного анализа (прямой, непрямой,
антикомплементарный), которые ныне официально используются как
методы экспрессной индикации и быстрого определения
микроорганизмов. Дальнейшее развитие весьма перспективного
иммунохимического направления во многом зависит от химиков, которые
должны разработать достаточно яркие новые красители, вступающие в
соединения со специфическими антителами и антигенами. В результате
могут быть получены препараты с новыми феноменологическими
свойствами, позволяющими проводить экспресс-индикацию микробных
культур и отдельных клеток с помощью широко распространенных
микроскопических устройств (типа МБИ различных марок).
Иммуноферментное направление, интенсивно развивающееся в последние
годы. Разработаны прямой, непрямой, антикомплементарный и другие
методы быстрого обнаружения микробов путем использования
иммуноэнзимологического принципа; предложены новые виды ферментов,
а также разнообразные виды хромогенных субстратов. Данное
направление является весьма перспективным, развитие его может
привести в ближайшие годы к появлению новых методов
экспресс-индикации микроорганизмов.
Иммуноэлектрофоретическое направление успешно развивается с конца
50-х годов. Разработаны многочисленные методы иммуноэлектрофореза.
Однако для целей экспресс-индикации микробов чаще прибегают к
встречному иммуноэлектрофорезу. Применение новых химических
красителей, ферментной или радиоактивной метки позволит резко
повысить чувствительность метода иммуноэлектропреципитации.
Иммунорадиологическое направление связано с использованием
разнообразных конъюгатов специфических антител или антигенов,
соединенных с радиоактивными веществами, которые придают им новые
феноменологические свойства и способности, р установить природу
возбудителя даже в тех случаях, когда другими методами, в виду его
изменчивости или загрязненности материала, он остается
нераспознанным.
Биологическое направление, связанное с изучением токсических и
агрессивных свойств патогенных микроорганизмов. Биологические
методы осуществляются на одноклеточных организмах, на культурах
клеток, куриных эмбрионах, а также на здоровых, а еще лучше
специально подготовленных лабораторных животных. Эти методы более
трудоемкие и менее точные по сравнению с другими.
Физико-химическое направление. Это направление связано с
использованием сравнительно быстрых, но в то же время и достаточно
сложных по аппаратурному оформлению методов. Сюда входят методы
изучения бактериальных популяций и их экстрактов с помощью
хроматографии (газожидкостная и др.), спектроскопии (инфракрасной,
ультрафиолетовой и др.), резистографии в отношении различных
антибиотических, химических и лекарственных веществ, а также методы
температурной и кислотной агрегации, коагуляции микробных суспензий
и их токсинов.
Рецепторное и генетическое направления быстрой индикации патогенных
и санитарно-показательных микроорганизмов. Методы, основанные на
этих принципах, только начинают развиваться. Так, с помощью
целлюлозно-глобулинового или эритроцитарно-глобулинового
диагностикумов быстро обнаруживают патогенный стафилококк,
содержащий белок А, а путем гомологии неизвестных нуклеиновых
кислот с известными нуклеиновыми кислотами устанавливают вид
патогена.
Комплексное направление ускоренной идентификации патогенных и
санитарно-показательных микроорганизмов, использующее методы
экспресс-индикации, основанные на интеграции различных принципов,
связано с разработкой и созданием индикаторных тест-систем,
позволяющих в течение короткого срока и с минимальными затратами на
анализ определить комплекс основных признаков патогена или
санитарно-показательного представителя, достаточных для его
идентификации до рода, вида и даже типа.
Направления, связанные с разработкой новых принципов
микробиологического анализа. Вполне вероятно, и мы вправе ожидать в
ближайшие 5-10 лет появления новых идей, подходов и принципов в
микробиологической науке и смежных с ней областях. Открытие новых
видов рецепторной, иммунологической и генетической специфичности у
микробов позволит создать новые и возможно более совершенные методы
быстрой идентификации микроорганизмов.
Основные пути развития экспресс-индикации микроорганизмов на
ближайшие годы:
создание и конструирование новых препаратов, способствующих
ускорению и удешевлению исследований, повышению эффективности
лабораторной диагностики инфекций и индикации патогенных и других
микроорганизмов. На этом пути предстоит сделать очень многое,
поскольку общепринятые диагностические препараты в значительной
степени исчерпали свои потенциальные возможности;
разработка новых более чувствительных, простых методов
лабораторного анализа.
разработка комплексных методов и видов исследований. Будет
продолжаться дальнейшая интеграция методов и видов исследований,
имеющих разные принципы действия, лежащие в их основе;
создание новых схем исследований. Поскольку лабораторная
диагностика инфекционных болезней, а также экспресс-индикация, хотя
и в меньшей степени, связаны с изучением комплекса различных
свойств и особенностей микроорганизмов с использованием обычно
разнообразных методов и приемов, основанных на различных принципах,
то создание новых схем исследований с применением новых методов
является объективной реальностью и важной задачей, вытекающей из
существа самого процесса развития микробиологического анализа;
разработка и создание новых методов регистрации и учета результатов
экспресс-индикационных и лабораторных исследований.
разработка новой микроминиатюрной лабораторной посуды, аппаратуры и
приборов для исследований;
автоматизация и компьютеризация исследований.
В современных условиях эти вопросы должны решаться комплексно.
Таким образом, рассмотре от 10 лиц. Флаконы помещают в термостат
при 370С. Через 3 — 4 часа холерные вибрионы начинают
агглютинироваться и постепенно (в течение ближайших 2 часов) падают
в виде хлопьев на дно флакона. Исследуя под микроскопом окрашенные
мазки и «висячую каплю», обнаруживают склеившихся и частично
свободных вибрионов. Через 6 часов дается ответ и в случае
обнаружения холерных вибрионов немедленно производится посев
индивидуально от каждого из 10 лиц. Такой метод дает возможность
исследовать до 16 000 человек за 3 — 4 дня. Метод
иммунодиагностической микропленки.
Изучение антигенных свойств
холерных вибрионов проводят путем постановки пробирочной или
пластинчатой реакции агглютинации с использованием сухих
лиофилизированных диагностических агглютинирующих холерных
0-сывороток и сывороток Огава и Инаба. Сыворотку разводят в
физиологическом растворе или дистиллированной воде и смешивают при
постановке агглютинации на стекле с исследуемой культурой
вибрионов. При подготовке сыворотки используется дополнительная
посуда, что усложняет работу бактериолога, а в оставшейся
разведенной сыворотке быстро прорастает бактериальная микрофлора и
инактивирует ее. Для изучения антигенной структуры холерных
вибрионов были разработан иммунодиагностический препарат в виде
микропленок разового применения, который обладал достаточной
специфичностью, демонстративностью и экономичностью.
Иммунодиагностические холерные микропленки (ИХМП) в виде полимерной
пленки с нанесенными высушенными каплями, фиксированными на бумаге,
содержат минимальное количество сыворотки, пленкообразующий
компонент и консервант. Пленкообразующий компонент связывает,
склеивает и фиксирует микроколичества ингредиентов к поверхности
носителя, исключает крошение микропленок; консервант предохраняет
препарат от разрушения при длительном хранении. Концентрация
диагностической сыворотки в ИХМП является достаточной, поскольку
после эмульгирования в капле физраствора, антитела содержатся в
титре 1:100, что полностью обеспечивает ход реакции. Тем самым
обеспечивается достаточная концентрация антител, снижается, расход
диагностической сыворотки и исключается возможность ее
неиспользования. При этом создаются условия для быстрого
растворения ИХМП, контакта ее с холерными вибрионами и проведения
реакции непосредственно на полимерной пленке. Готовые ИХМП хранят в
темном сухом месте при 4- 7°С в картонных коробках (срок годности 3
года — срок наблюдения) и по мере надобности ИХМП используют для
определения холерных вибрионов. Для исключения случайного заражения
окружающих предметов ИХМП помещают в чистую чашку Петри. На
поверхность ИХМП наносят каплю физиологического раствора, в которой
растворяют ее. Разведенную сыворотку смешивают с изучаемой
культурой вибрионов, снятой бактериологической петлей с питательной
среды. При другом варианте постановки реакции ИХМП снимают
скальпелем с бумажной подложки и переносят на предметное стекло,
растворяют в капле физиологического раствора и смешивают с
изучаемой культурой вибрионов. При положительной реакции через 1-3
мин появляются зерна агглютината, окрашенные в зеленый цвет, а
капля просветляется. При отрицательной реакции капля остается
гомогенно-мутной. Использованную часть полимерной пленки отрезают,
а оставшуюся часть пленки с ИХМП сохраняют в той же чашке Петри для
дальнейших исследований. Использование ИХМП в исследованиях
вибрионов и других микроорганизмов позволяет получить статистически
достоверные результаты, сэкономить дорогостоящие диагностические
сыворотки, повысить качество и эффективность исследований. Реакция
агглютинации микрометодом.
В последнее время в бактериологической практике нашел довольно
широкое применение микрообъемный метод постановки серологических
реакций с использованием специальных планшеток и микротитровальных
игл. Реакции агглютинации микрометодом ставят с холерными
агглютинирующими референс-сыворотками в полистроловых
микротитровальных планшетках с плоским или V-образ-ным дном,
предназначенных для иммунологическ агглютинировались в планшетках и
пробирках соответственно в 95 и 96% случаев. У холерных вибрионов
классического и эльтор биоваров серовара Огава соотношения в обеих
методиках были практически те же. Интересен факт, что при
постановке реакции агглютинации с RO-сывороткой наибольшее число
штаммов, агглютинирующихся RO-сывороткой до титра, было выявлено в
микрометоде; в пробирках агглютинация установлена у одного штамма.
Все штаммы вибрионов 040-056 сероваров в микрометоде не
агглютинировались холерными агглютинирующими сыворотками, а в
пробирках штамм II 258-1099 (040 серовара) агглютинировался всеми
холерными сыворотками. Большинство изученных штаммов представителей
семейства Enterobacteraceae также не агглютинировалось холерными
агглютинирующими сыворотками, за исключением Sh. flexneri 2503, у
которого в пробирках была выявлена агглютинация со всеми
сыворотками, и штамма S. typhimurium 21, у которого отмечена
неспецифическая реакция агглютинации со всеми сыворотками как в
пробирках, так и в планшетках. При пользовании этим методом расход
агглютинирующих сывороток уменьшается в 10 раз, значительно
сокращается время, необходимое для постановки реакции, и ускоряется
срок выдачи ответа. Кроме того, описанный метод менее
трудоемок.
Таким образом, стандартность, достоверность полученных результатов,
высокая экономичность метода позволяют рекомендовать его при
идентификации холерных вибрионов, изучении штаммов и популяции
штаммов холерных вибрионов по признаку агглютинабельности. А также:
Иммобилизация вибрионов холерными сыворотками и типовыми холерными
фагами. Капли испражнений или материала с поверхности пептонной
воды обрабатывают холерной О-сывороткой, типовыми сыворотками Огава
и Инаба или типовыми холерными фагами. Готовят из них препараты
«раздавленная капля», которые исследуют с помощью темнопольной и
фазовоконтрастной микроскопии. В положительном случае через 3-5
минут движение вибрионов прекращается. РИФ. Препараты из
исследуемого материала обрабатывают флюоресцирующей противохолерной
сывороткой и исследуют в люминесцентном микроскопе.
Положительным результатом считается обнаружение в препарате даже
единичных вибрионов с ярким желто-зеленым свечением в виде
блестящего ободка по периферии клетки. Положительный результат
можно получить через 1-2 часа после начала исследования при
концентрации вибрионов не менее 106 клеток в 1 мл., поэтому
рекомендуется предварительно подращивание материала на питательных
средах. Экспресс-диагностика туляремии Возбудитель туляремии
(Туляре — район Калифорнии) — Franciella tularensis относится к
роду с невыясненным положением в систематике микробов.
Этиологическая природа туляремии была установлена в 1912 году
Г.Мак-коем и Ш.Чепиным, а далее подробно изучена Э.Франсисом.
Туляремия — тяжелая кровяная зоонозная инфекция с природной
очаговостью. Основные источники инфекции — водяные крысы, ондатры,
зайцы, крысы, мыши. Больной человек неконтагиозен и для возбудителя
является биологическим тупиком. Передается трансмиссивным путем
через клещей, а нередко и контактным, алиментарным или
аспирационным путем. Возбудитель содержит нуклеопротеидный О- и
оболочечный белково-липидный Vi-антиген. У перенесших болезнь
вырабатывается очень напряженный и длительный иммунитет. Материал
для исследования: кровь, гной, пунктат бубона, слизь из зева.
Реакция агглютинации-рассеивания. Предложена простая, быстрая,
высокочувствительная и специфичная реакция
агглютинации-рассеивания, для постановки которой используется
антительный диагностикум. Это суспензия темно-коричневого цвета,
представляющая собой комплексное соединение шаровидных
крупнодисперсных НК-частиц (Никитин и Котич) и противотуляремийных
иммуноглобулинов. Препарат хранят в холодильнике при +4°С в течение
2-3 лет. По истечении 3 лет препарат можно ресенсибилизировать, так
как НК-частицы высокостабильны. Для постановки реакции
агглютинации-рассеивания на тщательно обезжиренное предметное
стекло наносят слева относятся также Y. pseudotuberculosis и Y.
enterocolitica, вызывающие септические гастроэнтероколиты или
иерсиниозы.
Чума — особо опасная, очень тяжелая кровяная инфекция, склонная к
широкому распространению и дающая высокий процент смертности (от 20
до 100%). Это зоонозная трансмиссивная природно-очаговая инфекция.
Источники — крысы, суслики, песчанки, полевки, сурки, мышевидные
грызуны. Переносчики — кровососущие насекомые. В составе бактерий
чумы содержится более полутора десятков специфических и групповых
антигенов. Переболевшие приобретают пожизненный, устойчивый
иммунитет фагоцитарного характера. Материал для исследования:
содержимое бубонов, отделяемое язв, мокрота, кровь, испражнения.
Метод бумажных индикаторных систем. Классические методы (посев на
среды Гисса) громоздки, требуют много времени и большого количества
питательных сред, имеющих ограниченный срок годности. В настоящее
время эти методы не удовлетворяют запросам противочумной системы. В
настоящее время наиболее перспективным методом определения
ферментативной активности штаммов возбудителя чумы с целью
идентификации выделяемых культур и изучения их свойств можно
считать метод углеводно-бумажных дисков, предложенный В.М.Никитиным
и С.В.Плугару. В качестве среды лучше использовать бульон
Хоттингера, т.к. он дает наиболее быструю ферментацию — 3 часа.
Целесообразно применять БИС в полевых условиях, так как наборы
компактны и могут длительное время храниться при комнатной
температуре. Фаготипирование. 1. Внесение бактериофага в
исследуемый материал в момент его посева на агар с генцианвиолетом
позволяет обнаружить под микроскопом негативные колонии фага или
«дорожку» в первые часы, когда рост бактерий еще почти не заметен
(через 2,5 — 3 часа). Метод прост, доступен и дает хорошие
результаты при высокой концентрации чумного микроба и при
относительно большом содержании посторонних микроорганизмов. 2.
Определение нарастания титра чумного фага, вносимого в исследуемый
материал, где в случае наличия возбудителя фаг начинает
размножаться уже через 30-40 минут. В жидкий исследуемый материал
(25-50-100 мл) и в контрольную жидкость добавляют столько фага,
чтобы получить его разведение 1:50 — 1:100; ставят пробы в
термостатах при 370C на 45-60 минут. После инкубации берут 0,5 мл
жидкости из каждой пробы и разводят бульоном в 10 раз; из этого
первого разведения фага готовят серию последовательных 10-кратных
разведений (до 10-10 — 10-11). По 0,5 мл жидкости из каждого
разведения исследуемого и контрольного рядов добавляют к 2,5 мл
полужидкого агара (0,1%), предварительно расплавленного и затем
охлажденного до 48-500С. Тут же к агару добавляют 0,1 — 0,2 мл
взвеси 1 — 2 суточной индикаторной культуры (вакцинный штамм
чумного микроба), содержащий 15-20 млрд микробов в 1 мл. Содержимое
пробирок тщательно перемешивают и выливают на чашки Петри с 2%
агаром Хоттингера. После того, как полужидкий агар застынет, чашки
перевертывают дном кверху и ставят в термостат при 370С. Учет
результатов производят через 3-4 часа. На фоне сплошного роста
индикаторной культуры видны стерильные пятна (негативные колонии
фага), количество которых на чашках с исследуемым материалом может
превосходить в 100-1000 и более раз число негативных колоний на
контрольных чашках. Благодаря хорошей диффузии фаговых частиц и
бактериальных клеток через полужидкий агар двухслойный метод дает
стерильные пятна большего размера, чем при размазывании исследуемой
массы шпателем по поверхности агара. Подсчет колоний ведут в
счетной камере. А также: РИФ, РПГА и др. Некоторые другие
методы
Хемилюминесцентный иммуноанализ. Новым этапом на пути развития
иммунологических методов диагностики ООИ является
хемилюминесцентный иммуноанализ — ХЛИА. Преимущество этого метода
определяется его высокой чувствительностью, относительной простотой
и производительностью, возможностью полной автоматизации В открытой
литературе имеются отдельные сообщения, посвященные применению ХЛИА
в медицинской микробиологии, как для обнаружения бактериальных
антигенов, так и Специфичность ХЛИА зависит от качества
использованных иммуноглобулинов. На 42 близкородственных и
гетероло-гичных штаммах положительные реакции получены с Y.
pseu-doTuberculosis 816111(37°) с чумными общими ИПК и В. sereus 1
и 3 с сибиреязвенными ИПК в концентрациях 1 -106 м. т./мл. ХЛИА
следует рекомендовать для лабораторной диагностики ООИ особенно в
тех случаях, когда в исследуемом материале предполагается
незначительное содержание возбудителя. Иммуноблотинг
Иммуноблоттинг — разновидность гетерогенного иммунного анализа.
Сущность его заключается в переносе молекул исследуемого вещества с
одного твердого носителя, используемого для фракционирования
биополимеров, на другой, где с помощью иммунохимической реакции
происходит их специфическое выявление. В зависимости от
исследуемого вещества различают ДНК,- РНК и белок — блоттинг. При
постановке иммуноблоттинга соблюдается следующая методическая
последовательность: электрофоретическое разделение анализируемого
материала на индивидуальные белки или полипептиды в геле; получение
реплики путем блоттинга белков или полипептидов с геля на
твердофазный матрикс; блокирование фона, отмывка от компонентов,
используемых при блокировании фона; инкубирование со специфической
тест-сывороткой; отмывка от избытка сыворотки; инкубирование с Jg к
антителам специфической тест-сыворотки, конъюгированными с меткой;
отмывка от избытка меченого иммунореагента; выявление тестируемых
антигенов авторадиографически или ферментативно по реакции с
соответствующим субстратом. Иммунохимическое выявление антигенов
можно проводить с помощью антител, конъюгированных с меткой. В
качестве метки в последнее время широко применяют либо
радиоактивные изотопы, либо ферменты (пероксидазу, щелочную
фосфатазу, лактамазу и др.). Время блоттинга путем диффузии
составляет 36-48 ч. Но наиболее быстрый и эффективный способ
переноса белков с гелей — электроблот, время которого, в основном,
составляет 1-3 ч (2), для некоторых высокомолекулярных белков-
более 12 ч. Конкретный выбор сорбентов для различных модификаций
блотов (нитроцеллюлоза либо бумага, обработанная соответствующим
образом), выбор условий блокирования и иммуно-химического выявления
антигенов полностью зависит от антигена, его количества, метода
иммуноанализа и целей исследования. Метод ИБ по целому ряду
обстоятельств получил наибольшее распространение как метод,
пригодный для использования в качестве теста подтверждения.
Безусловное достоинство метода — возможность тестирования антител к
слабо или вовсе нерастворимым антигенам и исключение стадии
введения радиоактивной метки в антигены. О чувствительности в
случае ИБ судят по предельному количеству нанесенного на гель
антигена, которое при фракционировании белков удается выявить
иммунохимически после переноса с геля на твердую фазу
(нитроцеллюлозу). Общая чувствительность анализа зависит от целого
ряда причин: условий фракционирования и иммобилизации антигена на
твердом носителе, уровня фона, специфичности и аффинности антител.
Важное значение имеет вид используемой метки и способ ее
выявления.
Таким образом, метод иммуноблотинга позволяет идентифицировать зоны
антигена на твердой фазе, не связывая весь белок с антителами
специфической сыворотки. Иммуноблотинг и его модификации в основном
используются для типирования бактериальных и вирусных антигенов и
антител, особенно в случае недостаточной разрешающей способности
обычных систем, а также при анализе иммуноглобулинов, нуклеиновых
кислот или как тест подтверждения в сочетании с другими методами.
Обнаружение возбудителей, антигенов и антител при помощи
суспензионных препаратов.
Принцип: фиксированные на частицах компоненты вступают в реакцию
антиген-антитело, которая сопровождается образованием крупных,
видимых невооруженным глазом агломератов. В суспензионных
препаратах для обнаружения и количественного определения антигенов
и антител используется свойство многих неорганических и
органических веществ, таких как активированный уголь, дерматол,
бентонит, каолин, гидроокись алюминия, си техническими
возможностями лаборатории, контингентом зараженных людей,
характером и масштабом распространения предполагаемой инфекции.
Диагностику необходимо провести в наиболее короткие сроки, так как
от этого зависит эффективность изоляции и лечения больных. При
работе с патологическим материалом важно учитывать и предупреждать
возможность заражения медицинского персонала, поэтому надо строго
соблюдать инструкции по сбору материала от больных. Классические
методы экспресс-диагностики в большинстве своем исчерпали себя, в
связи с этим необходимо разрабатывать принципиально новые, такие
как ПЦР и др. и автоматизировать существующие.
Таким образом, экспресс-диагностика ООИ и по сей день остается
актуальной и одной из важнейших задач микробиологии и
эпидемиологии. Список использованной литературы Ускоренные методы
диагностики инфекционных болезней (сб. тр.) -Кишинев, «ШТИИНЦА»,
1987. Препараты для экспресс-диагностики (сб. тр.) — Ленинград,
1981. Иммунохимия и лабораторная диагностика особо опасных инфекций
(сб. тр.) — Саратов, 1985. Щербак Ю.Ф. Особо опасные инфекции — М.,
«Медицина», 1975. Ранняя и дифференциальная диагностика основных
инфекционных заболеваний (уч.-мет. пособие) — Ленинград,1988.
Медицина катастроф (уч. пособие) — М., «ИНИ Лтд», 1996. Лебедева
М.Н. Руководство к практическим занятиям по медицинской
микробиологии — М., «Медицина», 1973. Борисов Л.Б., Козьмин-Соколов
Б.Н., Фрейдлин И.С. Руководство к лабораторным занятиям по
медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии — М.,
«Медицина», 1993. Повлович С.А. Медицинская микробиология в графах
— Минск, «Вышэйшая школа», 1986.
Экспресс-диагностика особо опасных инфекций
31
0
19 минут
Темы:
Понравилась работу? Лайкни ее и оставь свой комментарий!
Для автора это очень важно, это стимулирует его на новое творчество!