Наиболее часто используемым методом количественной оценки активности антител является определение их титра. Этой процедуре предшествует приготовление разведений (обычно двукратных) сыворотки. Далее каждое из них исследуется с соответствующими антиген позитивными эритроцитами в том методе, котором антитела проявляют свое действие. Процедура имеет ряд серьезных недостатков. Во первых, несмотря на тщательные усилия, происходит избыточный перенос сыворотки при приготовлении разведений. Во вторых, даже если разведения сыворотки приготовлены с большой точностью, различные константы антител одной и той же специфичности способны существенно влиять на результаты. N.C. Hughes-Jones показал, что даже если два вида антител присутствуют в сыворотке в одинаковых количествах, но обладают различными константами, различающимися на 10минут, то титр одного вида антител может превышать в 10 раз этот показатель для других. В третьих, результаты титрования, выполненного вручную, учитываются с известной долей субъективизма (также как и другие при выполнении проб на совместимость, фенотипирование) в то время как в данном случае главным является необходимость объективно отличить положительные результаты от отрицательных.
В результате существования этих трудностей были разработаны более точные и элегантные методы определения активности антител. Они включали прямую метку антител с использованием изотопов йода, использование анти-IgG, меченных йодом применение системы AutoAnalyzer. Все эти системы помогли разрешить многие проблемы, обусловленные различиями констант связывания различных видов антител и иммунопреципитации. Используя AutoAnalyzer, можно судить о концентрации антител в количественном отношении в нанаграммах на литр. Используя известные стандарты, стало возможным весьма точно оценить содержание антител в различных сыворотках.
Однако, все эти достижения по-прежнему остаются вне внимания большинства иммуногематологов - последние предпочитают по-старому определять активность антител методом титрования.
.
1.В каждую из 10 пробирок поместите 1 объем разводителя (обычный изотонический раствор)
2.В первую пробирку с разводителем добавьте равный объем титруемой сыворотки.
3.Перемешайте содержимое пробирки и перенесите один объем из нее в следующую пробирку с объемом разводителя.
4.Повторите описанную процедуру включая пробирку 10.
5.Теперь в пробирках приготовлены двукратные разведения от 1:2 до 1:1024.
6.Перенесите по 2 капли из пробирок с приготовленными разведениями по 2 капли в соответствующие пробирки, в которых приготовлены сухие капли эритроцитов. Может быть также выполнена проба с неразведенной сывороткой в отдельной пробирке.
7.Проводите серию тестов с приготовленными разведениями сыворотки.
Важные замечания по технике титрования
1.После переноса объема сыворотки или ее разведения в следующую пробирку замените наконечник пипетки-дозатора. Использование одной и той же пипетки или наконечника приведет к излишнему переносу титруемой сыворотки и значительному завышению значений титра антител.
2.Чем больше объемы приготовленных разведений, тем меньше погрешность при титровании, уровень ошибки обратно пропорционален объему используемой пипетки.
3.Антитела нестабильны в разведенном состоянии. После приготовления разведений титрование должно быть выполнено сразу.
4.Если требуется приготовить разведение 1:1024, то лучше приготовить разведение 1:1000 путем смешивания в отдельной пробирке 0,1 мл сыворотки с 99,9 мл изотонического раствора. Точность будет выше, если смешать 1 мл с 999 мл изотонического раствора.
5.Если титрование проводится с энзимированными эритроцитами (одноэтапный метод), в качестве разводителя следует использовать 50% сыворотку АВ группы, поскольку в больших разведениях сыворотки содержание белка очень незначительно - это может привести к гемолизу эритроцитов.
6.Если для исследования имеются небольшие объемы сыворотки, реакции по определению титра проводят прямо в приготовленных разведениях. При этом следует помнить, что такое титрование сопряжено с ошибками и погрешностями, которые отмечены в п.2 выше.
7.Поскольку результаты титрования не являются легко воспроизводимыми , следует использовать серийные методы исследований (описываются в главе 26, посвященной пренатальным серологическим тестам).
8.Moore и соавт. Рекомендуют использовать в качестве разводителя при титровании 1% раствор бычьего альбумина.
Точка конца титра
Правильный способ сообщить о результатах титрования - использовать величину, обратную наибольшему разведению, в котором наблюдается положительная реакция на 1+. Таким образом, о сыворотке, реагирующей неразведенной на 4+ , в разведении 1:2 на 3+, 2+ в разведении 1:4, 1+ в разведении 1:8, затем слабее, чем на 1+ в разведениях 1:16 и 1:32 и показывающая отрицательный результат в разведении 1:64 можно сказать, что она имеет титр 8 (не "1:8" - это не титр, а разведение!).Реакции с силой слабее 1+ обычно не принимаются во внимание при определении титра.
Система счета (score)
Существует также дополнительный способ характеристики активности антител, основанный на оценке в баллах силы положительных реакций в каждом разведении. Впервые предложенная система подсчета была десятибалльной, в ней троекратно положительная реакция оценивалась на 10 баллов, реакции силой в 2+ на 8 баллов, 1+ - на 5 баллов. Однако, в большинстве лабораторий максимально выраженные положительные реакции оценивают на 4+ и в этой связи применяют 12-балльную шкалу при подсчете показателя score. Для определения указанного показателя производят оценку в баллах всех положительных реакций, полученных при титровании сыворотки. Определение score часто полезно, когда с одной и той же сывороткой исследуют разные образцы эритроцитов или наоборот, оценивают антитела различных сывороток с одним и тем же образцом эритроцитов. Показатель score отражает не только титр, но также и авидность антител. Например, антитела двух различных сывороток могут иметь одинаковый титр 256, но при этом те из них, которые реагируют во всех разведениях на 1+ будут иметь невысокий показатель score, в то время как этот параметр будет существенно выше у другого образца антител, если при титровании получены положительные реакции выраженностью в 3+ или 4+. Очень часто различия в авидности антител либо экспрессии антигенов лучше демонстрируют показатели score, нежели значения титров. Система подсчета score, которой мы пользовались на протяжении долгих лет приведена далее в таблице.
Учитесь читать результаты титрования
Для того, чтобы не перестараться при учете показателей титра некоторые исследователи предпочитают вести учет результатов не с наименьших, а с наибольших разведений. Такой подход (наряду со сменой наконечников пипетки для титрования) позволяет избежать субъективизма при учете результатов титрования.
Тем, кто не верит в сложность процедуры титрования предлагаем поупражняться в этом следующим образом. Пусть Ваш коллега проведет титрование, перепутает порядок, в котором были установлены пробирки а Вам будет предложено оценить результаты и попытаться расставить их в правильной первоначальной последовательности - попробуйте, и Вы убедитесь, что это не так просто, как может показаться на первый взгляд!
Система подсчета score
| Сила реакций | Синонимы при учете реакции | Оценка в баллах score |
| Полная | ||
| 3,5 | слабая 4 или сильная 3 | |
| 2,5 | слабая 3 или сильная 2 | |
| 1,5 | слабая 2 или сильная 1 | |
| 0,5 | слабая 1 или± | |
| следы | ||
Эффект прозоны
Сравнительно редко антитела при титровании слабо или вовсе не реагируют будучи неразведенными или в начальных разведениях, а в разведениях 1:16 или 1:32 наблюдаются самые сильные реакции. Этот феномен известен как эффект прозоны и обусловлен избыточным количеством антител, которые способны заблокировать все антигенные детерминанты таким образом, что агглютинации не наступает. В действительности это одно из проявлений перенасыщения антигена антителами.
Этот феномен может сослужить плохую службу в тех ситуациях, когда исследуется сыворотка крови больного с сильной посттрансфузионной гемолитической реакцией. Если при исследовании получены отрицательные результаты, то рекомендуется их повторить с сывороткой, разведенной в 5 или 10 раз.
Феномен прозоны при титрованиях в аниглобулиновом тесте может иметь несколько причин, например конкуренцию между полными и неполными антителами за антигенные сайты, частичная элюция антител при отмывании или выраженная элюция антител перед добавлением антиглобулиновой сыворотки, что приводит к ее последующей нейтрализации. Наиболее часто он наблюдается при работе с анти-IgG компонентом антиглобулиновой сыворотки (см. более подробно главу 4).
Некоторые возможные результаты титрования и их интерпретация