Коллаген из гомогенатов тканей полностью экстрагируется горячим раствором ТХУ. При этом другие тканевые белки выпадают в осадок. В экстракте коллаген обнаруживается биуретовой реакцией.
Ход работы.В ступке 0,2 г сырой кожи (крысы, кролика) измельчить ножницами и, растерев до кашицеобразной массы, перенести в центрифужную пробирку, добавить 3,0 мл 5% раствора ТХУ, перемешать и поставить в водяную баню при 90о С на 10 мин. Затем пробирку центрифугировать 5 мин при 1500 об/мин, 0,5 - 1 мл центрифугата перенести в пробирку, добавить равный объем 10% раствора NaOH (КОН) и 1 каплю 1% раствора сернокислой меди. Отметить появление фиолетового окрашивания.
Работа № 2. Количественное определение свободного оксипролина в моче.
Принцип метода.Метод основан на окислении гидроксипролина пероксидом водорода в присутствии ионов меди (II) в щелочной среде до пиррола. Пиррол образует розовое окрашивание с парадиметиламинобензальдегидом в кислой среде. Интенсивность окрашивания раствора пропорциональна концентрации оксипролина.
Ход работы.В две пробирки (контроль и опыт) отмерить по 1 мл профильтрованной мочи, добавить по 1 мл 0,01 М раствора сернокислой меди, по 1 мл 2,5 М раствора NaOH и по 1 мл 6% раствора пергидроля. После перемешивания обе пробирки поместить на 10 мин в водяную баню при 70оС и периодически помешивать. Пробы охладить в воде со льдом (снегом), добавить в каждую пробирку по 4 мл 3 н раствора серной кислоты и по 2 мл реактива Эрлиха (5% раствор п-диметиламинобензальдегида в пропаноле или изопропаноле). Контроль оставить в воде со льдом, опыт нагреть до 100оС и кипятить в течение 80 сек. В опытной пробирке развивается розовое окрашивание. Содержимое обеих пробирок колориметрировать на ФЭКе при зеленом светофильтре в кюветах на 10 мм. Из экстинкции опыта вычесть экстинкцию контроля и по калибровочному графику найти содержание оксипролина в 1 мл мочи. Вычисляют количество оксипролина в 100 мл или суточном количестве мочи.
Норма.У взрослого человека с мочой за сутки выводится до 8 мг свободного оксипролина.
Клинико-диагностическое значение. Содержание оксипролина в крови и моче характеризует интенсивность катаболизма коллагена и скорость обмена этой аминокислоты. Оксипролин может находиться в связанном виде с белками, пептидами, а также в свободном состоянии в сыворотке крови и моче. Резко увеличивается экскреция гидроксипролина с мочой при коллагенозах (ревматизм, ревматоидный артрит, системная склеродермия, дерматомиозит), при гиперпаратиреоидизме, болезни Педжета (до 1 г за сутки). Еще больше выделяется оксипролина при наследственной гипергидроксипролинемии, что обусловлено дефицитом фермента гидроксипролиноксидазы, в результате чего и нарушается обмен гидроксипролина.
Работа № 3. Количественное определение гликозаминогликанов в коже.
О количестве гликозаминогликанов в тканях судят по содержанию одного из компонентов – гексуроновых (глюкуроновой и идуроновой) кислот, выделяемых кислотным гидролизом. Продукты гидратации гексуроновых кислот дают окрашенные соединения с карбазолом.
Ход работы.Измельчить ножницами 0,1 г кожи, растирать в ступке, добавляя щепотку кварцевого стекла и 1 мл 0,5 н раствора соляной кислоты. Гомогенат ткани перенести в пробирку, смывая 4 мл 0,5 н раствором соляной кислоты. Пробирку поставить на 20 мин в кипящую баню, охладить и профильтровать. 1 мл фильтрата перенести в чистую пробирку и при охлаждении в воде со льдом (снегом) прибавить 6 мл концентрированной серной кислоты. Осторожно (!) перемешать, охладить и затем поставить в кипящую баню еще на 20 мин. Пробирку охладить, добавить 0,2 мл 0,2% раствора карбазола в 96% этаноле и перемешать. Пробирку вновь поставить в кипящую баню на 20 мин. Развивается фиолетово-красное окрашивание. Через 10 мин содержимое пробирки колориметрировать на ФЭКе против концентрированной серной кислоты при зеленом светофильтре в сухих кюветах толщиной 10 мм. По калибровочному графику найти содержание гексуроновых кислот и рассчитать содержание в ткани гликозаминогликанов.
Расчет:допустим, экстинкция (Е) равна 0,14. По калибровочному графику эта экстинкция соответствует содержанию гексуроновых кислот 0,036 мг (С). Количество гликозаминогликанов (мг) в 100 г кожи находят по формуле:
Х= (5×С)×1,92×100/0,1, где
С - количество гексуроновых кислот (мг) в 1 мл гидролизата;
(5×С) – количество гексуроновых кислот (мг) в 5 мл гидролизата или 0,1 г кожи;
1,92 – коэффициент, соответствующий содержанию гексуроновых кислот в гликозаминогликанах;
0,1 г – навеска взятой ткани.
Норма. Содержание гликозаминогликанов в 100 г кожи равно 345,6 мг.
Работа № 4. Исследование минерального состава тканей кости и зуба.
А) Растворение солей костной ткани. Навеску кости перенести в колбу, прилить 10 мл 2 н раствора соляной кислоты, закрыть пробкой с обратным холодильником, поместить на сетку и нагреть до полного растворения кости. Содержимое колбы перенести в мерную колбу на 250 мл, внести 10 мл 2 н раствора едкого натра для нейтрализации содержимого и довести водой до метки.
Б) Открытие ионов кальция. К 10 каплям минерализата кости добавить 10 капель оксалата аммония, выпадает осадок.
В) Открытие неорганического фосфора. К 10 каплям минерализата кости прибавить 15 капель молибденового реактива и нагреть. Появляется осадок желтого цвета.
Г) Открытие сульфатов. К 10 каплям минерализата кости добавить 3 капли уксусной кислоты и 5 капель раствора хлористого бария. Выпадает осадок.
Д) Определение количества неорганического фосфора в костной ткани. Основано на способности фосфатов, содержащихся в минерализате, образовывать с молибденовым аммонием фосфомолибдат желтого цвета, который восстанавливается аскорбиновой кислотой в соединение, имеющее синюю окраску. Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству неорганического фосфора.
Ход работы.В пробирку внести 0,5 мл минерализата, 5 мл дистиллированной воды, 1 мл 2,5 % раствора молибденовокислого аммония, 0,4 мл 0,25% раствора аскорбиновой кислоты. Перемешать стеклянной палочкой и оставить стоять на 15 мин, затем колориметрировать на ФЭКе с красным светофильтром (635 нм) против воды. Подсчет количества фосфора произвести по калибровочному графику или по стандартному раствору фосфата калия, содержащего 0,04 мг фосфора в 1 мл. С ним проводят параллельно все реакции.
Е) Определение количества ионов кальция в костной ткани. Са2+ в кости определяют комплексонометрическим методом, титруя Са2+ раствором комплексона, который связывает эти ионы в практически недиссоцирующий комплекс. Момент полного связывания Са2+ узнается по изменению цвета индикатора мурексида. В качестве комплексонообразователя при определении Са2+ применяют натриевую соль ЭДТА (трилон Б).
Ход работы.В колбу налить 25 мл дистиллированной воды и внести пипеткой 0,25 мл 9 н раствора едкого натра. Добавить несколько кристаллов мурексида. Внести в колбу 1 мл гидролизата кости и титровать из бюретки раствором ЭДТА до перехода окраски в сине-фиолетовую (переход окраски в точке эквивалентности не очень четкий).
Расчет.Содержание ионов кальция вычислить по формуле:
Концентрация Са2+ (г) = 0,002×40,8×100×а×250/1×Р×1000 = 6,8×а, где
где: 250 - степень разведения;
0,002 – молярность раствора ЭДТА;
40,8 – атомный вес кальция;
1 - объем минерализата, взятый для исследования;
100 – пересчет в%;
а – количество ЭДТА, пошедшего на титрование;
Р – навеска кости (0,3 г);
1000 – перевод в граммы.
Работа № 5. Обнаружение белка в костной ткани.
Небольшой кусочек (50 мг) кости поместить в пробирку и добавить 10 капель 10% раствора едкого натра. Содержимое пробирки нагреть до кипения. Белки кости при нагревании растворяются в щелочи и могут быть обнаружены в растворе. Для реакции на белок пробирку охладить и добавить 1 каплю 1% раствора сульфата меди. Развивается фиолетовое окрашивание (положительная биуретовая реакция). Добавлять сернокислую медь в горячий раствор не следует, т.к. в этом случае выпадает осадок окиси меди, имеющей черный цвет.
Эталоны ответов на тесты контроля исходного уровня знаний
Вид 1. А) 3; Б) 1
Вид 2. А) 1Б, Ж; 2В, Е, А; 3Г, Д. Б) А2, В3, Д1
Вид 3. А) Д; Б) 4, 3, 8, 7, 2, 5, 1, 6, 4
Вид 4.А) А (+, +, +); Б) В (+, +, -)