Костанай, 2016
| Министерство образования и науки Республики Казахстан Костанайский государственный университет имени А. Байтурсынова «Допущена к защите» Зав. кафедрой ТППЖ _________________Г. Шайкамал ___ _____________20___г. ДИПЛОМНАЯ РАБОТА на тему: «Получение и характеристика культур стволовых клеток» по специальности 5В070100-Биотехнология Выполнила: Самуратова Д. М., студентка 4 курса специальности 5В07010-Биотехнология Научный руководитель:Шевченко П. В.,м.т.н.,преподаватель Костанай, 2016 Содержание Введение……………………………………………………………………...... 7 | |
| 1 Обзор литературы…………………………………………………………… | |
| 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 | Стволовые клетки и их характеристика........................................... Дифференцировка стволовых клеток……………………………... Эмбриональные и соматические стволовые клетки……………… Источники мезенхимальных стволовых клеток………………….. Особенности мезенхимальных стволовых клеток……………….. Пересадка мезенхимальных стволовых клеток…………………... Использование мезенхимальных стволовых клеток в медицине.. Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток……………. |
| 2 Материалы и методы исследования............................................................. | |
| 2.1 2.2 | Объекты исследования……………………………………………... Методы исследования……………………………………………… |
| 3 Результаты исследования………………………………………………....... | |
| 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 | Сравнение свойств МСК, культивируемых в нормоксии или в гипоксии……………………………………………………………... Ростовые характеристики и дифференцировка МСК……………. Иммунофенотип МСК……………………………………………… Проявление функциональной активности МСК при сокультивировании с лимфоидными клетками…………………... Охрана труда и окружающей среды………………………………. |
| Заключение ……………………………………………………………………. Список использованных источников………………………………………… |
Нормативные ссылки
В настоящей дипломной работе использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 17299-78 - Спирт этиловый технический. Технические условия.
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия .
ГОСТ 19126-79Е - Инструменты медицинские металлические. Общие технические условия.
ГОСТ 20730-75 – Питательные среды.
ГОСТ 25336 – 82 Пробирки биологические. Чашки Петри
ГОСТ 30204-95 - Приборы холодильные бытовые. Эксплуатационные характеристики и методы испытаний.
ГОСТ 33216-2014 Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами.
ГОСТ 555-81 - Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия.
ГОСТ 6709-72 - Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ 92-84 – 75 Предметные стекла
Определения
В настоящей дипломной работе применены следующие термины с соответствующими определениями:
Адипоцит– клетка, из которой в основном состоит жировая ткань.
Ассиметричный митоз – образование двух разных клеток, одна из которых способна делиться, а другая – утрачивает способность к делению, или из нее образуются клетки.
Гемопоэз – это процесс образования, развития и созревания клеток крови- лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов у позвоночных.
Гемопоэтическая стволовая клетка –мультипотентная стволовая клетка взрослого организма, способная к дифференцировке во все клетки крови.
Дифференцировка – возникновение различий между однородными клетками и тканями, изменения в ходе развития особи, приводящие к формированию специализированных клеток, органов и тканей.
Кардиомиоциты– мышечные клетки сердца.
Клеточная трансплантация –трансплантация (трансфузия) различных типов клеток с целью восстановления поврежденных тканей и органов, либо замещения патологически измененных собственных клеток реципиента.
Мезенхима –4-й зародышевый листок, образующийся из мезлдермы, дающий начало дерме, костям, хрящам и всей соединительной ткани организма.
Мезенхимальные стволовые клетки – плюрипотентные стволовые клетки, содержащиеся главным образом в костном мозге, способные дифференцироваться в костную, мышечную, хрящевую, жировую ткани.
Мультипотентность– способность клетки дифференцироваться в разные типы зрелых клеток одного вида ткани.
Недифференцированная клетка –клетка, не обладающая характеристиками клеток той или иной тканевой принадлежности и способная претерпевать процесс дифференцировки.
Остеобласты – молодые остеобразующие клетки кости, которые синтезируют межклеточное вещество – матрикс.
Пластичность –гипотетическая способность стволовых клеток взрослого организма дифференцироваться в клетки нескольких направлений дифференцировки – производных различных зародышевых листков под воздействием различных стимулов.
Плюрипотентность – способность клетки дифференцироваться во все типы клеток, кроме клеток внезародышевых органов (плаценты и желточного мешка).
Прогениторные клетки –стволовые клетки, детерминированные на дифференцировку в определенный тип клеток.
Пролиферация –процесс клеточного деления, осуществляющегося путем митоза.
Регенеративная медицина – область медицины, занимающаяся вопросами восстановления поврежденных или патологически измененных тканей и органов посредством трансплантации стволовых клеток, клеток – предшественников и управления их дифференцировкой.
Самообновление стволовых келток –способность стволовых клеток поддерживать себя в недиффференцированном состоянии. За счет микроокружения и влияния специфических ростовых факторов.
Симметричный митоз – наиболее распространенная в природе форма митоза, в результате которой получаются две одинаковые клетки.
Стволовость – способность к самообновлению и дифференцировке.
Стволовые клетки – недифференцированные (незрелые) клетки, способные самообновляться, посредством митоза и дифференцироваться в специализированные клетки, то есть превращаться в клетки различных органов и тканей.
Стромальные клетки – совокупность клеток преимущественно соединительнотканной природы (ММСК, ретикулярных клеток, адипоцитов, фибробластов) формирующих каркас кроветворных органов.
Тотипотентность – способность клетки путем деления дать начало любому клеточному типу организма.
Тканевая инженерия – междисциплинарная область знаний, включающая в себя биологию, медицину и технические науки, изучающая создание in vitro эквивалентов тканей и органов, использующая принцип трасплантации клеточной культуры на биосовместимом носителе.
Трансплантант - совокупность клеток, фрагмент ткани или орган, используемый для пересадки.
Фибробласты – клетки, соединительной ткани организма, синтезирующие внеклеточный матрикс.
Хондроциты – основные специализированные клетки хрящевой ткани, которые производят все компоненты хрящевого матрикса одновременно.
Эмбриональные стволовые клетки – тип плюрипотентных клеток, поддерживаемых в культуре, которые получают из внутренней клеточной массы бластоцисты на ранней стадии развития эмбриона
Обозначения и сокращения
В настоящей дипломной работе применены следующие обозначения и сокращения:
ед/мл - единица в одном миллилитре
ЖТ – жировая ткань
кл/мл – количество клеток в миллилитре
К-П – клетки-предшественники
мА - миллиампер
мкг/мл - микрограмм на миллилитр
мкл - микролитр
мл - миллилитр
млн - миллион
мм - миллиметр
МСК – мезенхимальные стволовые клетки
нг/мл - нанограмм на миллилитр
ПК – прогениторная клетка
об./мин – количество оборотов в минуту
см – сантиметр
СК – стволовые клетки
ФГА – фитогемагтлютинин
ФСР – фосфатно-солевой буфер
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭСК – эмбриональные стволовые клетки
ЭТС – эмбриональная телячья сыворотка
FBS - фетальная бычья сыворотка
°С – Градус
Введение
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) – это недифференцированные клетки, происходящие из мезодермального зародышевого листка, обладающие способностью к самоподдержанию популяции и дифференцировке в клетки мезенхимального ряда [1].
Впервые МСК были описаны как клетки костного мозга с фибробластоподобной морфологией, способные прикрепляться к поверхности культурального пластика и формировать колонии in vitro, а также дифференцироваться в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях. Термин «стволовая клетка» (нем. Stammzelle) был предложен к широкому использованию русским гистологом А. А Максимовым в 1908. Он описал гемопоэтические стволовые клетки и доказал их существование методами своего времени, именно для них был введён термин. А. А Максимов во многом предопределил направление развития мировой науки в области клеточной биологии. Несколько позже, в 1970 году профессор московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи, А. Я. Фриденштейн изучал возможности этих особых клеток и подтвердил предположение коллеги. Оказалось, что клетки костного мозга, эксплантированные в культуру, жизнеспособны и могут длительно пролиферировать. Они обладали высокой эффективностью клонирования и способностью дифференцироваться в другие типы клеток мезодермы. Клетки, первоначально названные как образующие колонии фибробласты (CFU-F), позже получили название мезенхимных стромальных (стволовых) клеток (МСК). В более поздних работах также была продемонстрирована способность МСК дифференцироваться в клетки эндотелия, кардиомиоциты, нейроны и астроциты [1].
В целостном организме МСК выполняют гомеостатические функции и служат для восполнения утраченных элементов кровеносных сосудов и опорно-двигательного аппарата, для заживления ран, для построения сосудистой сети плода и плаценты. Осуществление перечисленных функций МСК обеспечивается экспрессией генов, кодирующих широкий спектр адгезионных молекул, цитокинов, хемокинов и их рецепторов [2].
С этими свойствами, а также с возможностью культивирования МСК in vitro, связано их интенсивное изучение и применение в качестве основы для клеточной терапии различных заболеваний [3].
Актуальность. Мезенхимальные стволовые клетки служат прекрасной моделью для исследования важнейших проблем клеточной биологии и биологии развития – таких как механизмы гистогенеза и регенерации тканей, пути регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки [1].
В настоящее время в исследовании МСК достигнут значительный прогресс: охарактеризованы профиль экспрессии генов и спектр продуцируемых цитокинов, исследовано влияние условий культивирования на пролиферацию и дифференцировку un vitro, выявлены сигнальные пути, контролирующие основные направления дифференцировки, частично раскрыты механизмы направленной миграции в поврежденные ткани и участия в их регенерации [5].
Клетки с характеристиками МСК обнаружены в большинстве тканей и органов как развивающегося, так и зрелого организма. По-видимому, они локализуются в соединительной ткани, сопровождающей кровеносные сосуды и, согласно мнению ряда авторов, представляют собой специализированные перициты или адвентициальные клетки. МСК различной органной локализации в целом сходны между собой по морфологии, иммунофенотипическим характеристикам и широте потенциала к дифференцировке[2].
Цель настоящей работы состояла в том, чтобы в пределах одного исследования, с помощью стандартизованных методических приемов сравнить функциональные характеристики МСК, выделенных из костного мозга и жировой ткани мышей и изучение их биологических характеристик.
В соответствии с указанной целью в работе были поставлены следующие задачи:
1) Получить первичные культуры МСК из костного мозга и жировой ткани и сравнить свойства МСК, культивируемых в нормоксии и в гипоксии.
2) Сравнить ростовые характеристики и способность МСК к дифференцировке.
3) Сопоставить иммунофенотипические характеристики МСК, выделенных из указанных источников.
Обзор литературы