Большую важность для получения точных результатов ТЛЧ представляет приготовление среды, содержащей лекарственный препарат. Ниже приведены критические концентрации лекарственных препаратов в среде Л-Й:
Изониазид 0,2 мкг/мл
Стрептомицин 4 мкг/мл
Рифампицин 40 мкг/мл
Этамбутол 2 мкг/мл
При приготовлении среды с препаратами необходимо учитывать активность препарата, которая может варьировать от одной партии/серии лекарств к другой и в зависимости от его производителя. Эти сведения приводятся на этикетках контейнеров, упаковках или предоставляются компанией-изготовителем.
Изониазид:
Содержание активного вещества 1000 мкг/мл
1) Приготовление растворов лекарственных препаратов:
a) 20 мг изониазида растворить в 10 мл дистиллированной воды - полученный раствор имеет концентрацию 2000 мкг/мл
b) 1 мл приготовленного раствора (2000мкг/мл) растворить в 9 мл дистиллированной воды; полученный раствор имеет концентрацию 200 мкг/мл
c) 1 мл раствора (200 мкг/мл) растворить в 9 мл дистиллированной воды - полученный рабочий раствор имеет концентрацию 20 мкг/мл
2) 2 мл рабочего раствора (20 мкг/мл) добавить к 200 мл среды Л-Й
3) Питательную среду с лекарственным препаратом разлить в пробирки по 6 мл
4) Свертывание среды проводится при 900 C в течение 50 мин.
Стрептомицин:
Содержание активного вещества 780 – 800 мкг/мг
Процедура приготовления среды с 4 мкг/мл (чистое вещество 780мкг/мг)
1) Приготовление раствора лекарственного препарата: 5,1 мг S растворить в 10 мл дистиллированной воды - полученный раствор имеет концентрацию 400 мкг/мл
2) 2 мл полученного раствора добавить к 200 мл среды Л-Й
3) Питательную среду с лекарственным препаратом разлить в пробирки по 6 мл
4) Свертывание среды проводится при 900 C в течение 50 мин
Рифампицин:
Содержание активного вещества 1,000 мкг/мл
1) Приготовление раствора лекарственного препарата: 40 мг R растворить в 10 мл пропиленгликоля, встряхивая на водяной бане при 700C - полученный раствор имеет концентрацию 400 мкг/мл
2) 2 мл полученного раствора добавить к 200 мл среды Л-Й
3) Питательную среду с лекарственным препаратом разлить в пробирки по 6 мл
4) Свертывание среды проводится при 900 C в течение 50 мин
Этамбутол:
Содержание активного вещества 1,000 мкг/мл
Приготовление раствора лекарственного препарата:
1) 20 мг E растворить в 10 мл дистиллированной воды - полученный раствор имеет концентрацию 2000 мкг/мл
2) Добавить 1 мл полученного раствора (2000 мкг/мл) к 9 мл дистиллированной воды – полученный рабочий раствор имеет концентрацию 200 мкг/мл
3) 2 мл рабочего раствор добавить к 200 мл среды Л-Й
4) Питательную среду с лекарственным препаратом разлить в пробирки по 6 мл
5) Свертывание среды проводится пр 900 C в течение 50 мин
Приготовление бактериальной суспензии
Выросшую культуру микобактерий снимают с питательной среды Л-Й с помощью металлической петли и помещают в пробирку с 5-6 стеклянными бусами. При использовании металлической петли в пробирку внести предварительно 2 капли стерильной дистиллированной воды. Пробирку с бактериальной массой гомогенизируют в течение 1- 2 минут на встряхивателе «Vortex», затем добавляют 7 мл дистиллированной воды и снова осторожно встряхивают до образования однородного раствора
Полученную суспензию оставляют на 1-3 минуты до осаждения крупных частиц. Затем гомогенную взвесь (верхнюю часть суспензии) собирают и переносят в стерильную пробирку. Мутность гомогенной взвеси сравнивают со стандартом Мак-Фарланда №1, постепенно добавляя дистиллированную воду до тех пор, пока густота взвеси не сравняется с густотой стандарта. Полученная суспензия называется «рабочей суспензией».
В дальнейшем из рабочей суспензии готовятся последовательные десятикратные разведения: 10- 1; 10-2; 10-3; и 10-4
(для каждой суспензии используются разные 1мл градуированные пипетки).
Посев бактериальной суспензии:
a) в 2 пробирки со средой Л-Й без лекарств (контрольная пробирка) делают посев 0,1 мл суспензии разведенной до 10-2 , 10-4 и распределяют по всей поверхности среды.
b) в 2 пробирки со средой Л-Й, содержащей каждое лекарство делают посев 0,1 мл суспензии разведенной до 10-2 и распределяют по всей поверхности среды.
Пробирки в термостате хранят в наклонном положении с неплотно прикрытыми крышками при температуре 370 C, до появления видимого роста на среде без лекарств, после чего в течение 4-6 недель с закупоренными пробками.
Интерпретация результатов
Критерием устойчивости является 1% роста бактериальной популяции для всех этих препаратов. Через 4 недели инкубации, рост на среде, не содержащей лекарства, инокулированной из суспензии 10-4 сравнивают с ростом на среде с препаратом, инокулированной из суспензии 10-2. Если число колоний больше на среде, содержащей лекарство, тестируемый штамм считается устойчивым.
Так как отношение 10-2 и 10-4 является как 1:100, то следующая формула может использоваться для подсчета % устойчивости:
Число колоний на среде с лекарствами в разведении 10-2 = % устойчивости
Число колоний на среде без лекарств в разведении 10-4
Если рост бактерий на питательной среде, содержащей лекарство, превышает 1%, штамм считается устойчивым.
Контроль качества работы бактериологических лабораторий
3.9.1 Внутренний контроль качества бактериологической лаборатории направлен на:
- размещение лаборатории и организацию работы;
- лабораторное оборудование;
- качество материала;
- обработку материала;
- качество, годность и количество реагентов;
- методика и процедура посева;
- регистрация анализов и выдача результатов.
Внутренний контроль качества – это ответственность всего персонала лаборатории!
3.9.1.1 Размещение лаборатории и организация работы:
- Убедитесь, что двери лаборатории всегда закрыты. Посторонние лица не должны находиться в помещении лаборатории. Рабочие помещения, оборудование и расходные материалы располагаются так, чтобы обеспечить эффективную и безопасную работу
- Уборка помещения проводится в соответствии с утвержденным графиком. Рабочие поверхности столов следует обрабатывать не менее 1 раз в день раствором дезинфектанта
- Лаборатории должны использовать методики утвержденные МЗ РК
- Детальное описание каждой методики, применяемой в лаборатории, должно храниться в доступном месте
- Все лабораторные журналы и картотеку следует хранить не менее 5 лет
3.9.1.2 Лабораторное оборудование:
- Оборудование должно использоваться в соответствии с требованиями и спецификациями производителя
- Руководство по эксплуатации оборудования следует держать в доступном месте
- В паспорта к оборудованию регулярно вносятся даты сервисного обслуживания
- Оборудование должно регулярно проверяться специалистом
3.9.1.2.1 Биологический шкаф безопасности:
- Место установки БШБ должно находиться вдали от входа в лабораторию и располагаться в стороне от проходов (движение воздуха от проходящих мимо людей может нарушать воздушный занавес). Этот занавес весьма хрупкий и открытые окна или оборудование, создающее движение воздуха (центрифуги) не следует располагать вблизи БШБ.
- Особое внимание следует уделять эксплуатации и своевременной замене фильтров.
- Работа в БШБ требует ежедневной проверки скорости воздушного потока (22,86 м/с для БШБ I класса и 22,86- 30,48 м/с для БШБ II класса) и показателей манометра давления воздуха, поступающего на фильтр. В случае минимального превышения отмеченного уровня необходимо заменить фильтр.
Центрифуги
Каждые 6 месяцев необходимо проверять щетки в электродвигателях.
Инкубатор
Регистрировать температуру в термостате ежедневно. Необходимо проверять разницу температур внутри термостата на различных уровнях.
Свертыватель
Ежедневно проверять температуру. После каждой партии сред тщательно обрабатывать свертыватель.
Водяная баня
Контролировать температуру до и во время использования. Ежемесячно производить тщательную обработку и чистку.
3.9.1.2.6 Холодильник (2-8ºС):
Ежедневно контролировать температуру. Ежемесячно проводить обработку, каждые 3 месяца удалять лед из морозильной камеры.
Морозильник
Ежедневно проверять температуру, чистить раз в 6 месяцев.